MIKROSKOP KONFOKALNY

Obserwacja preparatów niewidocznych gołym okiem to podstawowa czynność, którą wykonują laboratoria na całym świecie. Dynamiczny rozwój mikroskopii fluorescencyjnej przełożył się na ogromny postęp w naukach biologicznych. Dzięki nowoczesnej technologii, możliwe było skonstruowanie mikroskopu konfokalnego (confocal microscope), który pozwala uzyskać obrazy fluorescencyjne o lepszej, niż przy użyciu mikroskopu szerokiego pola, jakości.
Możliwość uzyskania obrazów prezentujących większą liczbę szczegółów stało się możliwe dzięki zastosowaniu takich elementów budowy mikroskopu jak przysłona konfokalna, lasery, bardzo czułe detektory (APD, PMT) oraz zaawansowane elementy układu optycznego jak precyzyjne obiektywy i filtry.

Skanujące laserowe mikroskopy konfokalne a lepsza rozdzielczość tworzonych obrazów

Współczesne mikroskopy konfokalne (confocal microscopes) umożliwiają tworzenie bardzo cienkich przekrojów optycznych preparatów, co pozwala na obserwację wielu detali badanych próbek i tworzenie trójwymiarowych rekonstrukcji. Wykorzystanie mikroskopu konfokalnego pozwala na poprawę rozdzielczości i kontrastu uzyskanych obrazów, ponieważ dzięki przysłonie konfokalnej światło dociera do detektora jedynie z płaszczyzny ogniskowania, a nie z całego preparatu. Wykonane obrazy można poddać obróbce (odszumianie, dekonwolucja), aby otrzymać jeszcze lepszą rozdzielczość i stosunek sygnału do szumu (SNR). Przysłona konfokalna pozwala dodatkowo poprawić zdolność rozdzielczą układu jeśli średnica otwarcia będzie mniejsza niż 1 AU a sygnał fluorescencyjny wystarczająco mocny. 

Mikroskop konfokalny.

Mikroskop konfokalny — jakie są jego zalety?

Mikroskop konfokalny to rewolucyjne urządzenie, który posiada wiele zalet, pośród których wymienia się: 

    •  bardzo wysoki kontrast i lepszą rozdzielczość niżeli w tradycyjnych mikroskopach,

    •  możliwość rejestracji przekrojów optycznych a następnie rekonstrukcja obrazów 3D/4D, 

    •  możliwość rejestracji kilku barwników fluorescencyjnych jednocześnie,

    •  skuteczną eliminację problemu poświaty, która wynika z warstw preparatu leżących poza płaszczyzną ogniskowania,

    •  możliwość użycia technik takich jak FLIM, FRAP, FLIP, FCS, FRET,

    •  możliwość obrazowania mikroorganizmów, komórek ssaczych, tkanek a nawet całych organizmów.

Zastosowanie mikroskopu konfokalnego w praktyce

   •  Badania morfologii komórek i tkanek
 
    •  Badania wirusów i bakterii
 
    •  Badania strukturalne białek
 
    •  Badanie chromatyny i jej zmian strukturalnych 
 
    •  Badania zmian patologicznych w tkankach
 
    •  Badania FRET
 
    •  Badania komórek macierzystych
 
    •  Badania dynamiki białek z użyciem techniki FRAP, FCS, FLIP
 
    •  Obrazowanie Czasów Życia Fluorescencji (FLIM)
 
    •  Obrazowanie wielofotonowe 
 
    •  Badanie procesów komórkowych w czasie rzeczywistym w komórkach żywych. 

Mikroskopia wielofotonowa - kilka informacji o metodzie bez ograniczeń

Pomimo ogromnych możliwości mikroskopii konfokalnej, jednym z jej poważniejszych ograniczeń jest niewielka głębokość penetracji próbek, która wynika z długości fali używanego światła laserowego. Dlatego właśnie mikroskopia wielofotonowa cieszy się coraz większą popularnością w obrazowaniu grubych preparatów, jak tkanki czy całe organizmy. W tej odmianie wzbudzenie fluoroforu dokonuje się przede wszystkim za pomocą dwóch niskoenergetycznych fotonów, których energia całkowita jest równa energii wzbudzenia. Zasadnicza przewaga tej techniki polega na niskiej fototoksyczności i wzbudzeniu fluoroforu głównie w miejscu skupienia wiązki światła. 

Przyjmuje się, że mikroskopia dwufotonowa ma możliwość tworzenia obrazów odpowiednich przekrojów optycznych ponad pięć razy głębiej niż standardowe mikroskopy konfokalne. Jeszcze inną zaletą systemu jest używanie fotonów o mniejszej energii, np.  światła podczerwonego o znacznie mniejszym rozproszeniu w tkance niż w przypadku światła z zakresu widzialnego.  

Poznaj typy mikroskopów konfokalnych

Niewątpliwie mikroskopia konfokalna to innowacyjna i bardzo rozwojowa technika do badania różnych materiałów i próbek. Do prowadzenia obserwacji i badań wykorzystuje zaawansowane mikroskopy, które działają z niewyobrażalną precyzją. Współcześnie najczęściej wykorzystuje się dwa rodzaje mikroskopów konfokalnych takie jak:

    1. Skanujące laserowe mikroskopy konfokalne (laser scanning confocal microscopes), które dają obraz wysokiej jakości, ale posiadają znacznie dłuższy czas obrazowania ze względu na rejestrację sygnału punkt po punkcie.

    2. Mikroskopy konfokalne z wirującym dyskiem (spinning-disk confocal microscopes), które pozwalają na niezwykle szybkie zbieranie obrazów z wykorzystaniem kamery jako detektora, ale będąc jednocześnie mniej wszechstronnymi od mikroskopów konfokalnych. 

Przewiń do góry